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主角
Rebecca Chambers（瑞贝卡·查姆博斯）
姓名：Rebecca Chambers
年龄：18岁
身高：161CM
体重：42.1KG
血型：AB
人物背景简介
刚入队的S.T.A.R.S.布拉瓦小队新队员，大学毕业，成绩优异，是个天才化学少女。
性格活泼开朗，在前作中也有过登场，不过那时看起来她好像帮不了太大的忙，而且有时会给主角带来麻烦，不过在《生化危机1复刻版》中，对她的性格描写有了一点改变，可能是为了《生化危机0》做基础吧，这次的《生化危机0》，女主角由她担当。
Billy Coen（比利·柯恩）
姓名：Billy Coen
年龄：26
身高：181CM
体重：74.2KG
血型：A
人物背景简介
在本作中，瑞贝卡有一个同伴名叫比利。
比利原本是海军少尉，因为虐杀23人的罪名而被判死刑，在被转送到基地行刑的途中，有人袭击运送车，比利乘机逃走。
比利在列车内与怪物激战，掩护瑞贝卡，之后两个人便成为了同伴，他是个外冷内热的人，很有正义感，如果被命令去做不对的事情，他绝不会服从，而且他还有一个特长，就是他会弹钢琴。
Albert Wesker（阿尔伯特·威斯克）
姓名：Albert Wesker
年龄：38
身高：183CM
体重：84.5KG
血型：O
人物背景简介
他可以说是一个神秘的人物，有着冷静的判断力的他数年前由国际企业Umberlla转到了S.T.A.R.S.，那时这里正面临解散，正因为有了他才维持到今天！
William Birkin（威廉·柏肯）
姓名：William Birkin
年龄：32
身高：178CM
体重：66.7KG
血型：O
人物背景简介
是开发T病毒及G病毒的权威人士，之后为了保护自己的研究成果，而自己注射G病毒。也就是雪莉的父亲。起初为人很好，可是最后变成了怪物。
神秘男子
姓名：詹姆斯·马库斯
年龄：70
身高：？
体重：68.5
血型：A
人物背景简介
安布雷拉干部培训所的初代所长，同时也是与奥斯威尔.E.斯宾塞、爱德华.亚希福特一同发现始祖病毒的人。
在史宾赛的建议下，三人一起创立了安布雷拉公司。之后马库斯潜心进行了始祖病毒的研究，并将病毒与水蛭DNA结合最终开发了以造就生物兵器为目的的T病毒，在安布雷拉树立了极高的威信。
不过，随着研究的进展，马库斯的人格也慢慢产生了扭曲，他已不满足仅仅以动物进行试验，而是将目光瞄准了人类。不久，干部培训所就有二十位后备干部死在了他手中，这在安布雷拉内部是一件讳莫如深的事情。斯宾塞害怕马库斯如果继续进行研究的话会威胁到自己的地位，因此派威廉和威斯克暗杀了马库斯。
然而，令史宾塞意想不到的是，被扔到下水道中的马库斯由于水蛭女王病毒的作用并未死去，而是在不为人知的情况以十年的时间死而复生，成为了一个与水蛭结合的生命体。1998年复活的马库斯开始利用体内的病毒和召唤水蛭的能力实行他报复安布雷拉的计划，而阿克雷研究所，干部培训所，浣熊市地下处理厂等地相继发生的病毒泄露事故也都是他的杰作。马库斯本以为他可以凭借自己的力量夺取世界，但是两个年轻人---瑞贝卡、比利却让他的野心化作泡影。
在本作中，他的穿着十分特殊，胸前带着一个青石项链，袖口上的花纹也十分的特别，还有他光着脚，他是《生化危机0》的最终BOSS，在几年前被其徒弟威斯克与柏肯所杀，但因为病毒的泄漏，使他与水蛭女皇病毒合体，创造出一个两性的水蛭人。之后为了报复安布雷拉公司，把一大堆水蛭病毒释放到列车上，造成了惨剧。之后的“洋馆事件”，“浣熊市覆灭”也都是他制造的悲剧。
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